检测肺癌中的微血管密度及其临床意义

中国肺癌杂志 2000年第4期第3卷 论著

作者：车国卫　周清华　张尚福　刘伦旭　陈军　成娘　秦建军　李潞

单位：车国卫　周清华　刘伦旭　陈军　秦建军（610041　成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科）；张尚福　成娘（病理科）；李潞（肿瘤中心）

关键词：肺肿瘤；微血管密度；预后

　　【摘要】　目的　研究肺癌组织中微血管密度(micro-vascular density, MVD)与肺癌病理生理特征及预后的关系。方法　采用免疫组化LSAB法，检测114例肺癌组织、30例肺良性病变组织中的MVD。结果　①肺癌组织中MVD(30.37±10.56)显著高于肺良性病变组织(10.23±6.29)(P＜0.01)；②MVD与肺癌原发肿瘤大小，淋巴结转移状态，P-TNM分期，细胞分化程度等均有密切关系(P＜0.01)，而与肺癌患者性别、年龄、吸烟史、肺癌原发部位、组织学类型等均无明显关系(P＞0.05)；③肺癌组织中MVD高密度(MVD≥30)组患者5年生存率(17.27％)明显低于低密度(MVD＜30)组5年生存率(52.74％)(P＜0.01)；④MVD与肺癌患者术后生存期呈显著负相关(r＝－0.521，P＜0.01)；⑤多因素COX模型分析发现：P-TNM分期和MVD是判断肺癌预后最有价值的指标。结论　MVD在肺癌的发生、发展、转移中起重要作用，可作为肺癌生物学行为的一项评估指标，检测肺癌中MVD有助于预测肺癌预后及指导术后多学科综合治疗。

　　【中图分类号】　R734.2；R730.23

Detection of micro-vascular density(MVD) and its clinical significance in lung cancer

CHE Guowei　ZHOU Qinghua　ZHANG Shangfu　LIU Lunxu　CHEN Jun　CHENG Niang　QIN Jianjun　LI Lu

　　（Department of Thoracocardiac Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China）

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between MVD of lung cancer tissues and the pathophysiological characteristics and prognosis in patients with lung cancer. Methods　The MVD was detected in 114 lung cancer tissues, 30 benign pulmonary tissues by immunohistochemical staining (LSAB method). Results　MVD in lung cancer tissues (30.47±10.56) was significantly higher than that in benign pulmonary tissues (10.23±6.92)(P＜0.01); The MVD was closely related to the size of primary cancer, lymph node status, P-TNM stages, grade of cell differentiation of lung cancer (P＜0.01), but not to the histological classification and site of the cancer, and age, sex and smoking or not in the patients with lung cancer (P＜0.05); The 5-year survival rate in patients (17.27％) with high MVD (≥30) was significantly lower than that in patients (52.74％) with low MVD (＜30)(P＜0.01); The survival time of patients with lung cancer was negatively related to MVD (r＝－0.521,P＜0.01); The results of multivariable COX model showed that the P-TNM and MVD were the most significant variables for predicting prognosis among the all related factors in lung cancer. Conclusion　Increase of MVD may play an important role in the oncogenesis, development, metastasis of lung cancer and might be served as a tumor marker to evaluate the biological behavior of lung cancer. Detection of MVD might be helpful to predict prognosis and guide the postoperative multi-modality therapy in patients with lung cancer.

　　【Key words】　Lung neoplasms　　MVD　　Prognosis

　　肺癌的转移是一个极其复杂的多步骤的发展过程，涉及广泛的肿瘤—宿主，细胞—基质的相互作用^［1］。越来越多的证据显示，肿瘤的血管生成和微血管密度(micro-vascular density, MVD)与肿瘤转移的发生、发展和患者预后有密切关系。通过对实体肿瘤瘤灶内微血管数量的检测发现，多种实体肿瘤原发癌组织内的MVD与局部淋巴结转移和远处转移明显相关，MVD高者局部淋巴结和远处转移率高。在乳腺癌中高MVD与淋巴结转移和生存率降低相关，在非小细胞肺癌中与肿瘤增殖和转移有关^［2］。对于淋巴结阴性乳腺癌患者，多因素分析表明，其MVD相对于肿瘤分级、肿瘤的大小、雌激素受体阳性或其他标志物来说，是一更好的判断乳腺癌转移潜能的指标。由此可见，肿瘤的生长、转移、复发、预后与血管生成有密切关系^［3］。为探讨肺癌组织中MVD与肺癌临床病理生理特征和肺癌患者预后的关系，我们应用免疫组化法对114例肺癌组织中的MVD进行检测，并以30例肺良性病变作为对照。现将结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　组织标本　114例肺癌标本均来自华西医大附属第一医院胸心外科自1991年1月至1995年4月接受手术治疗的患者，其中男性95例，女性19例，平均年龄54.25岁；腺癌50例，鳞癌42例，腺鳞癌22例；低分化癌41例，中分化癌48例，高分化癌25例；P-TNM分期(国际UICC 1997分期标准)，Ⅰ＋Ⅱ期56例，Ⅲ＋Ⅳ期58例。患者术前均未接受化疗及放疗。另选择同期手术治疗的30例肺良性病变组织作为对照。

　　1.2　随访　本组患者的随访均由我院胸心外科完成，随访率为87.7％，失访率为12.3％。随访时间为患者出院到死亡或失访，截止时间为2000年4月，失访患者纳入死亡病例计算。

　　1.3　LSAB法－免疫组化染色

　　1.3.1　主要试剂　抗F-Ⅷ蛋白多克隆抗体购自Zemyd公司，生物素化标记的多抗羊抗兔抗体购自DAKO公司，SP复合物购自DAKO公司。

　　1.3.2　LSAB法染色　将5μm厚的石蜡切片常规脱蜡，逐渐水化，先经3％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，0.01mol／L枸缘酸缓冲液行抗原修复，再依次加入3％小牛血清(1∶10)，F-Ⅷ抗体(1∶100)，生物素化羊抗兔抗体(1∶200)，SP复合物(1∶200)。以上各步之间均经37℃恒温箱孵育30分钟，PBS冲洗(小牛血清除外)，最后DAB染色，苏木素复染，树脂封片。用PBS代替F-Ⅷ抗体为空白对照，用已知乳腺癌组织切片作阳性对照。

　　1.3.3　结果判定　微血管定位于癌灶或间质内，以Weidener^［4］计数标准计算肿瘤组织内着色的毛细血管和微血管，单个内皮细胞也计为一个血管，每张切片在200倍镜下选定3个血管数最多的视野(0.723mm²)，取其平均值为MVD。

　　1.3.4　统计方法　采用t检验，F检验，直线相关分析，多元相关分析，Kaplan Meier生存曲线，COX比例风险模型，在SPSS9.0软件上进行分析。

　　2　结果

　　2.1　不同肺组织中MVD的比较　肺癌组织中MVD为30.47±10.56，肺良性病变肺组织中MVD为10.23±6.92。肺癌组织中MVD显著高于肺良性病变肺组织(P＜0.01)(图1、2)。

图 1　肺良性病变组织中血管内皮细胞表达

　　阳性细胞浆呈棕黄色(FⅧ-Ab，1∶100，LSAB法×175)

Fig 1　FⅧ-factor expression of vascular endothelial cell in benign pulmonary tissue. Positive cell cytoplasm showed brown-yellow(FⅧ-Ab,1∶100,LSAB method×175)

图 2　肺癌组织中血管内皮细胞表达

　　阳性细胞浆呈棕黄色(FⅧ-Ab，1∶100，LSAB法×350)

Fig 2　FⅧ-factor expression of vascular endothelial cell in lung cancer tissue. Positive cell cytoplasm showed brown-yellow(FⅧ-Ab,1∶100,LSAB method×350)

　　2.2　MVD与肺癌临床病理生理特征的关系　MVD与肺癌原发肿瘤大小(T)、淋巴结转移状态(N)、P-TNM分期和细胞分化程度有密切关系(P＜0.01)，而与肿瘤部位、组织学类型，以及患者性别、年龄和吸烟与否等均无明显关系(P＞0.05)(表1)。

表 1　MVD与肺癌病理生理特征的关系

Tab 1　The relationship between MVD and clinical

　　pathophysiological characteristics of lung cancer

　　2.3　MVD与肺癌临床病理生理特征的相关性　多元相关性分析结果显示MVD与原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、远处转移和术后病理分期呈非常显著正相关(P＜0.01)，与肺癌细胞分化程度呈非常显著负相关(P＜0.01)；MVD与肿瘤部位、患者性别、年龄，以及吸烟与否均无显著相关性(P＞0.05)(表2)。

表 2　MVD与肺癌临床病理特征的多因素相关分析

Tab 2　The correlation of MVD and clinicopathology in lung cancer by multivariables analysis

　　Note:HC, histological classification; DF, differentiation.2.4　MVD与肺癌患者术后生存率的关系　经Kaplan-Meier生存曲线分析，MVD高密度组患者(MVD≥30)的5年生存率为17.27％，低密度组患者(MVD＜30)的5年生存率为52.27％，两组间5年生存率比较有非常显著性差异(P＜0.01)(图3)。

图 3　MVD高密度组(Group l)和低密度组(Group 2)肺癌患者生存曲线(Kaplan Meier曲线)(对数秩检验P＜0.01)

Fig 3　Kaplan-Meier survival curves in lung cancer patients with high (Group 1) and low (Group 2) MVD (Log Rank test P＜0.01)

　　2.5　MVD与肺癌患者术后生存时间的关系　直线相关分析显示，肺癌组织中MVD与肺癌患者术后生存时间呈显著负相关(r＝－0.521，P＜0.01)，即MVD越高，生存时间越短；反之则生存时间越长。

　　2.6　检测肺癌组织中MVD在预测肺癌患者预后中的意义　应用COX比例风险模型分析8种可能在预测肺癌预后中有意义的临床病理生理指标，结果显示P-TNM分期和MVD是预测肺癌预后最有意义的指标(P＜0.01和P＜0.05)(表3)。

表 3　多元COX比例风险模型分析结果

Tab 3　The results of multivariable COX model

　　3　讨论　　目前已知肿瘤的发生和发展大体可分为两个阶段，即肿瘤细胞的克隆性增殖阶段及继之而来的血管生成促进肿瘤持续性生长阶段，实体瘤的生长和转移均必须依赖于血管生成(angiogensis)^［1］。当肿瘤体积达到1～2mm³时，其体积要继续扩大就必须依赖于新生血管来维持^［5］。肿瘤在其生长过程中能诱导某些血管生成因子及受体的表达，血管生长因子及其受体的表达与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关。原发肿瘤的生长需要有新的血管生成，而转移癌要继续生长同样亦需要有血管生成。一些研究显示原发肿瘤的组织切片微血管计数(MVC)与肿瘤生长和转移均有密切关系。如转移癌不具有诱导肿瘤血管生成活性的能力，可使已发生转移的微小转移灶进入休眠状态^［6］。本研究应用免疫组化法检测114例肺癌组织中的MVD，并以30例肺良性病变肺组织作对照，以探讨检测肺癌组织中MVD的临床意义。本研究观察到肺癌组织中MVD显著高于肺良性疾病肺组织，且与肺癌原发肿瘤大小(T)、淋巴结转移状态(N)、P-TNM分期和细胞分化程度均有密切关系，而与肿瘤部位、组织学类型，以及患者性别、年龄和吸烟与否等均无明显关系。

　　肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，它受多种血管生成的正负调节因子的调控。无论是在体外还是动物体内试验，Li等^［7］观察到VEGF抗体均能明显抑制肿瘤的生长、肿瘤血管生成、肺转移发生率和远处其它器官转移。上述结果从一个侧面反映了VEGF的表达水平对肿瘤的生长速率、癌内MVD对原发肿瘤的生长、淋巴结转移，以及远处转移等均有明显的影响。肿瘤组织中平均MVD可从一个侧面反映出肿瘤组织和肿瘤细胞的微环境状态，对肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和转移均起至关重要的作用，并将影响肿瘤的病理生理特征和患者预后。本研究经多元相关分析显示：肺癌组织中MVD与肺癌原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、P-TNM分期呈非常显著正相关，与肺癌细胞分化程度呈非常显著负相关，而与肺癌部位、组织学类型、患者性别、年龄，以及吸烟与否均无明显相关。本研究结果进一步证明肺癌血管生成在肺癌发生、发展、侵袭和转移中起重要作用。

　　许多研究表明：VEGF高表达，MVD增高与黑色素瘤的恶性程度和不良预后有关，在前列腺癌和结肠癌中与肿瘤转移和患者生存率降低密切相关^［8］。本研究观察到肺癌组织中高MVD(MVD≥30)组患者的5年生存率(17.24％)显著低于低MVD(MVD＜30)组患者(57.24％)(P＜0.01)。直线相关分析结果显示肺癌组织中MVD与肺癌患者术后生存时间呈非常显著负相关(P＜0.01)。本研究结果进一步表明：肺癌组织中MVD与患者术后生存有密切关系，肺癌通过诱导血管生成一方面促进肿瘤的发生和发展，另一方面促进肿瘤转移而影响患者生存。

　　有关MVD能否作为判断肿瘤预后的一个指标，目前尚存争议。Mattern等^［9］对肺表皮样细胞癌研究发现MVD和PI(proliferation index)可作为判断肺癌预后的指标。而Fine等^［10］对卵巢癌中VEGF、MVD的研究表明VEGF、MVD对肿瘤的转移、复发、生存期影响较小。有研究发现MVD对预测Ⅰ、Ⅱ期肺癌预后的价值不大，而对预测Ⅲ、Ⅳ期肺癌预后的判断价值较大，甚至超过术后病理分期本身^［11］。本研究应用COX比例风险模型分析了8种对预测肺癌预后可能有意义的指标，结果显示P-TNM和肺癌组织中MVD是预测肺癌患者预后最有意义的指标。

　　本课题受国家自然科学基金(39670718)资助

参考文献

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　　10，Fine BA, Vlente PT, Feinstein GI, et al. VEGF, Flt-1, and KDR／FLK-1 as prognostic indicators in endometrial carcinoma. Gynecol Oncol,2000,76(1)∶33-39.

　　11，Angeletti CA, Lucchi M, Fontanini G, et al. Prognostic significance of tumoral angiogenesis in completely resected late stage lung carcinoma (stage ⅢA-N2). Impact of adjuvant therapies in a subset of patients at high risk of recurrence. Cancer,1996,78(3)∶409-415.

(收稿：2000-02-16　　修回：2000-03-28)