紫杉醇及其联合化疗对表浅性膀胱癌化疗敏感性的实验研究
中华泌尿外科杂志 1999年第7期第20卷 论著
作者：申吉泓 徐鸿毅 石永福 李泽惠 王剑松 李炯明 杨德林 李玛琳 陈荣喜
单位：650101 昆明医学院第二附属医院泌尿外科(申吉泓、徐鸿毅、石永福、李泽惠、王剑松、李炯明、杨德林)，烧伤研究室(陈荣喜)；昆明医学院天然药物重点实验室(李玛琳)
关键词： 膀胱肿瘤；癌；联合化疗
【摘要】目的 探讨紫杉醇及其联合化疗对表浅性膀胱癌的应用前景。方法 自1995年7月～1997年10月采用肿瘤细胞原代培养技术和MTT比色法测定了30例不同个体膀胱癌细胞及膀胱癌E-J细胞系的化疗敏感性。结果 紫杉醇对不同个体的膀胱癌细胞的总敏感率为16.7%，阿霉素和丝裂霉素分别为16.7%和26.7%，三者间差异无显著性，但优于顺铂和噻口 替哌；紫杉醇与顺铂或丝裂霉素联合后的协同性最佳，总敏感率均为83.3%；膀胱癌细胞系的抑制率与不同个体膀胱癌细胞对相同化疗方案的抑制率差异很大。结论 紫杉醇联合顺铂或丝裂霉素是可选择的灌注治疗方案；临床上应针对不同病人选择最敏感化疗方案；膀胱癌细胞系的化疗药物敏感性不能代表不同个体膀胱癌细胞的敏感性。
Chemosensitivity of taxol and taxol combinate for superficial bladder cancer
SHEN Jihong,XU Hongyi,SHI Yongfu,et al.
Department of Urology,The Second Affiliatd Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650101
【Abstract】 Objective To evaluate the use of taxol and taxol combinate in the treatment of superficial bladder cancer. Methods From July 1995 to Oct 1997, chemosensitivity of 30 superficial bladder cancer samples from different individuals and E-J bladder cancer cell line was tested by taxol and taxol combinate by means of MTT assay and primary tumor cell calture. Results Total sensitive ratio of single agent, taxol is 16.7%,no difference being noted as compared with ADM or MMC while it was superior to CDDP or TT.The total sensitive rate of taxol combinate with CDDP or MMC was 83.3% and were found to be the most synergistic. Diversity of chemosensitivity was observed in samples from different individuals. Bladder cancer cell line as compared to individual bladder cancer sample has been parallel in total sensitive ratio. Conclusions Taxol combinate with CDDP or MMC can enhance the therapeufic effect in treating superficial bladder cancer.In chemotherapy of bladder cancer for different individuals the most sensitive agents should be selected.The sensitive ratio of bladder cancer cell line would not represent individual chemotherapy sensitivity.
【Key words】 Bladder neoplasms Carcinoma Combination chemotherapy
紫杉醇是近年来发现的化疗新药，与其它药物联合可治疗多种癌瘤。本研究以30例膀胱癌细胞为研究对象，比较不同个体膀胱癌细胞对不同化疗方案的敏感性，并与膀胱癌E-J细胞系进行了对比研究。
资料与方法
一、临床资料
本组30例，均为1995年7月至1997年10月收治病 人。男22例，女8例。年龄16～79岁，平均61岁。均为移行细胞癌，其中表浅性膀胱癌(T0～T1)20例，浸润性膀胱癌(T2～T4)10例；G1 14例，G2～3 16例；单发20例，多发10例。
二、实验材料
E-J细胞系由北京医科大学泌尿外科研究所赠送。化疗药物：所用紫杉醇(Taxol)、顺铂(CDDP)、阿霉素(ADM)、噻口 替哌(TT)、丝裂霉素C (MMC)以生理盐水配成浓度为1mg/ml的浓度，-30℃冻存(不超过3个月 )。临用前解冻以含血清的RPMI 1640液配成浓度为40μg/ml及20μg/ml使用。
三、方法
将取下的膀胱癌组织修剪洗净后，将肿瘤组织尽量剪碎，经100目和200目不锈钢筛网两次过滤得细胞悬液，离心去上清液，加入全培养液混匀，层加于淋巴细胞分离液上，1 800r/min离心20分钟，收集界面处肿瘤细胞，经RPMI 1640液洗涤两遍后，调整细胞浓度至7×105/ml。参照Mosmann［1］的MTT比色法将单细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl(含7×104个细胞)，另设无细胞空白孔。因ADM、CDDP、MMC有颜色，同时设这三种药物的无细胞空白组。摇匀后置CO2培养箱孵育4小时，根据不同药物组合分为A～Ⅰ 8组，分别加入各组药物溶液，单种药物组加入20μg/ml的药物溶液100μl；两种药物联合组加入浓度为40μg/ml的药物溶液各50μl。设无药对照组，培养箱中孵育24小时，去上清液，每孔加入RPMI 1640液配成的1mg/ml MTT液50μl，孵育4小时，每孔加入DMSO 150μl溶解甲月 赞结晶，静置过夜后，用酶标仪测定波长为570nm时每孔吸光度A值。
E-J细胞系取对数生长期细胞，经消化后，以全培养液调整细胞浓度至3×105/ml，接种至96孔板，培养24小时后，完成上述加药、比色等步骤。以对膀胱癌细胞的抑制率大于或等于50%判定为敏感化疗药物。计算抑制率(IR)公式：IR=(1-
)×100%(A实=实验孔平均吸光度A值，A对=对照孔平均吸光度A值，A空=相应空白孔平均吸光度A值)。
结果
一、紫杉醇等药物及以紫杉醇为主的联合用药对不同个体膀胱癌细胞抑制率及敏感性的比较
在30例原代培养的膀胱癌细胞中，各组对不同个体膀胱癌细胞的抑制率差异很大(表1)，如ADM的抑制率为11.7%～77.1%，Taxol+ADM的抑制率为20.5%～83.4%。经统计学分析，Ta-xol+CDDP及Taxol+MMC抑制率最高，其次为Taxol+ADM，再次是Taxol+TT、MMC及ADM，抑制率最低的方案为Taxol、CDDP、TT。敏感率比较，除Taxol与Taxol+TT、MMC、ADM差异无显著性外，其余结果与抑制率的比较相同。本研究结果显示，不同个体膀胱癌细胞对相同化疗方案存在着敏感性差异，紫杉醇联合化疗可以显著提高膀胱癌细胞的敏感性。
表1 不同化疗方案对不同个体膀胱癌细胞的抑制率(%)
| 病例 |
A组
Taxol |
B组
ADM |
C组
CDDP |
D组
TT |
E组
MMC |
F组
Taxol+ADM |
G组
Taxol+CDDP |
H组
Taxol+TT |
I组
Taxol+MMC |
| 1 |
57.3 |
24.6 |
35.7 |
9.2 |
37.2 |
62.7 |
97.0 |
68.6 |
74.8 |
| 2 |
73.5 |
77.1 |
20.8 |
57.7 |
61.6 |
83.4 |
84.7 |
53.2 |
70.5 |
| 3 |
39.2 |
42.4 |
24.4 |
34.3 |
31.2 |
48.0 |
49.1 |
32.7 |
51.7 |
| 4 |
0 |
31.0 |
37.5 |
30.0 |
34.2 |
32.2 |
69.1 |
28.6 |
42.1 |
| 5 |
23.8 |
57.7 |
18.1 |
32.4 |
34.1 |
46.7 |
54.3 |
26.6 |
38.7 |
| 6 |
0 |
30.9 |
16.7 |
20.6 |
50.3 |
26.4 |
70.0 |
22.5 |
46.4 |
| 7 |
20.4 |
27.5 |
35.1 |
0 |
70.6 |
32.7 |
89.4 |
57.7 |
85.9 |
| 8 |
0 |
39.6 |
17.4 |
43.6 |
40.2 |
43.6 |
49.8 |
77.9 |
76.3 |
| 9 |
32.2 |
43.4 |
41.9 |
5.1 |
58.7 |
63.2 |
63.8 |
37.4 |
67.8 |
| 10 |
54.6 |
34.1 |
0 |
9.7 |
29.9 |
47.3 |
68.4 |
67.1 |
52.8 |
| 11 |
61.5 |
50.5 |
0 |
23.0 |
31.2 |
65.4 |
79.0 |
36.4 |
67.3 |
| 12 |
12.9 |
31.7 |
43.0 |
10.9 |
30.3 |
67.0 |
48.8 |
10.0 |
42.7 |
| 13 |
10.1 |
28.5 |
14.7 |
23.4 |
39.5 |
37.0 |
49.2 |
43.4 |
56.8 |
| 14 |
35.7 |
23.6 |
38.1 |
7.0 |
43.8 |
62.4 |
63.9 |
24.7 |
76.7 |
| 15 |
10.7 |
13.6 |
40.5 |
6.3 |
40.5 |
33.7 |
65.5 |
17.4 |
77.9 |
| 16 |
12.1 |
16.9 |
56.6 |
1.7 |
42.7 |
59.6 |
72.7 |
29.4 |
81.8 |
| 17 |
17.1 |
53.3 |
43.4 |
15.9 |
46.2 |
74.5 |
94.9 |
53.7 |
98.7 |
| 18 |
36.9 |
20.5 |
11.9 |
34.3 |
47.1 |
45.1 |
57.6 |
52.5 |
74.9 |
| 19 |
35.0 |
33.0 |
44.2 |
0 |
29.7 |
30.2 |
64.2 |
33.1 |
49.9 |
| 20 |
31.7 |
42.7 |
22.5 |
46.2 |
51.2 |
62.7 |
89.5 |
69.4 |
100 |
| 21 |
23.0 |
40.4 |
35.5 |
16.2 |
61.2 |
69.7 |
65.7 |
44.3 |
59.6 |
| 22 |
7.4 |
11.9 |
29.6 |
47.3 |
42.5 |
23.0 |
54.2 |
57.8 |
63.9 |
| 23 |
37.2 |
28.6 |
22.4 |
32.3 |
54.2 |
52.7 |
74.3 |
37.1 |
69.4 |
| 24 |
57.3 |
21.4 |
37.5 |
46.2 |
32.2 |
51.6 |
87.1 |
54.6 |
77.3 |
| 25 |
17.5 |
48.3 |
13.5 |
37.1 |
5.4 |
51.2 |
61.7 |
42.0 |
27.7 |
| 26 |
34.3 |
46.1 |
37.9 |
7.2 |
32.0 |
69.2 |
54.3 |
17.7 |
52.9 |
| 27 |
48.3 |
11.7 |
27.7 |
37.0 |
42.3 |
20.5 |
50.3 |
32.6 |
81.5 |
| 28 |
42.3 |
55.4 |
6.7 |
0 |
41.0 |
70.5 |
61.1 |
27.5 |
79.3 |
| 29 |
6.7 |
37.5 |
27.6 |
35.3 |
47.2 |
41.2 |
46.6 |
31.4 |
51.3 |
| 30 |
43.2 |
33.5 |
47.3 |
3.2 |
24.5 |
54.1 |
95.4 |
32.3 |
61.6 |
注：G组与I组比：P＞0.05；G组I组与F组比：P＜0.01；F组与B、E、H组比：P＜0.05；B、E、H组与A、C、D组之间比：P＜0.05二、膀胱癌病理分期、细胞分级、多发性与化疗药物敏感性的关系
20例表浅性膀胱癌中，G1 10例，G2～3 10例；单发15例，多发5例。经统计学分析，不同个体膀胱癌细胞对化疗药物的敏感性与其病理分期，细胞分级和多发性差异无显著性(P＞0.05)。
三、E-J细胞系与不同化疗方案敏感性间的关系(表2)
表2 不同化疗方案对膀胱癌E-J细胞系的抑制率(%)
| 实验次数 |
Taxol |
ADM |
CDDP |
TT |
MMC |
Taxol+ADM |
Taxol+CDDP |
Taxol+TT |
Taxol+MMC |
| 1 |
33.7 |
56.3 |
49.8 |
32.7 |
61.3 |
72.0 |
87.3 |
34.6 |
93.5 |
| 2 |
29.7 |
48.4 |
47.3 |
31.6 |
58.7 |
69.5 |
89.3 |
37.4 |
95.3 |
各化疗药物中对E-J细胞系的敏感性，单一药物组以MMC的抑制率最高，Taxol联合用药组以Taxol联合MMC或CDDP的抑制率最高，各联合用药组的抑制率均高于组内单一用药组，总体结果与原代培养细胞平行，但抑制率要高。
讨论
表浅性膀胱癌约占膀胱肿瘤的70%～80%，其中约30%～90%的病人在初次治疗后易复发，且复发后有约30%以上的病例会发展成为浸润性膀胱癌［2，3］。膀胱灌注化疗是表浅性膀胱癌重要的治疗手段，但目前常用的化疗药物及方式均未能取得满意疗效。紫杉醇因其相对分子质量大，抗癌机理有独特性，因而更适用于灌注治疗膀胱癌，并且以紫杉醇为主的联合化疗已对体内多种癌肿取得了成功的经验［4］。
本研究所采用的原代培养方法预测化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，其优点在于直接取材于刚刚离体的肿瘤组织，生物学性状尚未发生大的改变，能较真实地反映整个肿瘤细胞的群体特征及不同个体间的差异。肖若芝等［5］对10例急性非淋巴细胞白血病患者进行体外联合药敏试验，临床相符率达90%；Saikawa等［6］对148例胃癌患者的化疗敏感性进行检测，发现体外敏感化疗组的生存率明显高于体外培养不敏感化疗组和未化疗组。
同一种化疗药物对于不同病人往往出现疗效上的巨大差异，这与肿瘤细胞的异质性有着密切关系。Schimittgen等［7］测定了14例膀胱癌细胞体外试验对MMC的敏感性，发现个体差异达61倍。本研究结果也显示不同个体的膀胱癌细胞对同一化疗方案存在明显差异，提示临床化疗应针对不同个体选择敏感性药物。同时，ADM、MMC、TT、CDDP等药物的敏感率与临床实际疗效是相吻合的，在单一用药组中Taxol与MMC和ADM敏感率差异无显著性，可以作为表浅性膀胱癌灌注选择的药物之一。此外，几种化疗药物的敏感性与膀胱癌病理分期、分级、多发性无关，可能是在体内环境中肿瘤生长除自身因素外，还受到机体免疫系统等多种因素的影响。
E-J细胞系在相同条件下与不同个体的膀胱癌细胞的药物敏感性进行比较，总体上两者虽然存在平行，但与不同个体之间比较，也存在着差异，并且抑制率较原代培养的膀胱癌细胞高。这可能是传代细胞系在构成上相对单一，原代培养的细胞则存在群体上的差异性，构成上存在着周期敏感细胞，G0期细胞、退化衰老细胞以及耐药细胞，药物敏感细胞等，因此，以膀胱癌细胞系的药敏结果直接指导不同个体的膀胱癌患者用药是不妥的。
针对膀胱癌细胞多种复杂的耐药机制，联合化疗可以利用抗癌机理不同的药物的协同作用，提高化疗敏感性。联合化疗也已在其他癌肿的治疗中取得了成功的验证，如以M-VAC方案(氨甲喋呤，长春花碱，阿霉素、顺铂)对浸润性膀胱癌化疗的结果显示，联合后的疗效优于该方案中任何单一药物的疗效［8］。Seraphim等［9］发现ADM与TT联合后表现出对膀胱癌细胞系很强的协同作用。Sekine等［10］对43例G3膀胱癌患者联合应用MMC和ADM进行灌注化疗，完全反应率达74%。本研究结果也显示各联合化疗组对肿瘤细胞的抑制率均优于组内构成的任何单一药物，其中又以Taxol联合CDDP及MMC疗效最佳,因此可做为表浅性膀胱癌的推荐治疗方案。
参考文献
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9 Seraphim LA, Perrapato SD, Slocum HR.In vitro study of the interaction of doxorubicin, thiotepa and mitomycin C. agents used for intravesical chemotherapy of superficial bladder cancer. J Urol, 1991, 145∶613-617.
10 Sekine H, Fukui I, Yamada T, et al. Intravesical mitomycin C and doxorubicin sequential therapy for carcinoma in situ of bladder: a longer follow up result. J Urol, 1994 ,151∶27-30.
(收稿：1998-07-18 修回：1999-03-05)
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