p16和cyclin D1在膀胱癌中的表达及其相关性研究

中华泌尿外科杂志 1999年第7期第20卷 论著

作者：缪思满　罗义麒　王向宇　黄纲雄　曹林升　林曦

单位：350005 福州，福建医科大学附属第一医院泌尿外科(缪思满、罗义麒、曹林升、林曦)，高血压病研究所(王向宇)；福建医科大学病理教研室(黄纲雄)

　　关键词： 膀胱肿瘤；基因；免疫组织化学

　　【摘要】　目的　研究p16和cyclin D₁在膀胱癌组织中的表达，探讨其与膀胱癌生物学行为的关系。　方法　应用免疫组化法观察50例膀胱癌p16和cyclin D₁的表达情况。　结果　 (1)膀胱癌组织中p16阳性率为44%,明显低于正常膀胱粘膜(P＜0.01);cyclin D₁阳性率为62%,明显高于正常膀胱粘膜(P＜0.01)。随着肿瘤恶性程度的增高和临床分期的进展,p16阳性率下降, cyclinD₁阳性率升高。p16在未复发组、存活组的表达率显著高于复发组、死亡组(P＜0.01)。cyclin D₁在存活组的表达率显著低于死亡组(P＜0.05)。(2)p16与cyclinD₁的表达呈负相关。(3)有15%的病例存在p16和cyclin D₁同时表达或失表达。　结论　p16与cyclin D₁异常表达在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用。

p16 and cyclin D₁ gene expressions in bladder transitional cell carcinoma

MIAO Siman, LUO Yiqi, WANG XiangYu, et al.

　　Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005

　　【Abstract】　Objective　To investigate p16 and cyclin D₁ gene expressions and to evaluate their significance in biological behavior of the tumor.　Methods　 p16 and cyclin D₁ gene expression in 50 cases of transitional cell carcinoma (TCC) were detected by immunohistochemistry.　Results　(1)The positive rate of p16 gene expression in TCC (44%) was lower than that in normal bladder mucosa (P＜0.01) while the positive rate of cyclin D₁ gene expression in TCC (62%) was higher than that in normal bladder mucosa(P＜0.01). With the progress of the tumor grade and clinical stage, the positive rate of p16 gene expression in TCC increased while that of cyclin D₁ decreased. p16 gene expression in the non-recurrent group and the survival group was higher as compared with the recurrent group and the dead group (P＜0.05). While cyclin D₁ in the survival group was lower as compared with the dead group (P＜0.05). (2) p16 gene expression was negatively correlated to cyclin D₁ gene expression. (3) Abscence and presence of both the genes occurred in 15%.　Conclusions　The abnormal expression of p16 or cyclin D₁ genes played an important role in the genesis and progression of TCC.

　　【Key words】　 Bladder neoplasms　　Genes　　Immunohistochemistry

　　为检测膀胱癌组织中癌基因和抑癌基因的存在状态,探讨其相互关系及与膀胱癌生物学行为的关系,用免疫组化方法对50例膀胱移行细胞癌进行研究、分析。

　　材料和方法

　　一、标本来源

　　选取1991～1994年我院及福建医科大学病理室50例膀胱移行细胞癌蜡块,行HE染色复查诊断及免疫组化研究。临床分期按UICC及TNM标准分为:浅表性肿瘤Tis～T₁ 15例,浸润性肿瘤T₂～T₄　35例;病理分级按WHO法:Ⅰ级12例,Ⅱ级17例,Ⅲ级21例。其中33例有完整的随访材料。

　　二、试剂

　　兔抗人p16及cyclin D₁多克隆抗体购自Santa Cruz公司。SP免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术公司。

　　三、免疫组织化学染色(SP法)

　　石蜡切片常规脱蜡脱水,1%H₂O₂甲醇封闭内源性过氧化物酶30分钟,10%正常山羊血封闭非特异性背景30分钟,依次加入一抗 (兔抗人p16或cyclin D₁多克隆抗体1∶100, 4℃过夜),二抗(生物素化羊抗兔IgG 1∶100,30分钟),链霉素亲生物素蛋白-过氧化酶10分钟,以上各步间均以PBS缓冲液振洗3次,DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。以胞浆或胞核中出现棕褐黄色颗粒为阳性反应,p16的免疫反应产物定位于胞浆中,cyclin D₁的免疫反应产物定位于胞核中。实验中以胃癌阳性切片作为p16和cyclin D₁的阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　四、统计学处理

　　χ²检验及精确概率法分析组间差异。

　　结果

　　一、p16和cyclin D₁与膀胱癌生物学行为关系

　　p16阳性表达在膀胱癌组与癌旁组织、正常粘膜组比较，P＜0.01。临床分期：Tis～T₁组与T₂～T₄组比较，P＜0.05。病理分级Ⅰ级与Ⅲ级比较，P＜0.05；Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级比较，P＞0.05。 复发组与未复发组比较，死亡组与存活组比较，P＜0.01。cyclin D₁阳性表达在膀胱癌组与正常粘膜组比较，P＜0.05。Tis～T₁组与T₂～T₄组比较，病理分级：Ⅰ级与Ⅲ级比较，P＜0.05；Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级比较，P＞0.05。复发组与未复发组比较,P＞0.05,死亡组与存活组比较，P＜0.05(表1)。复发组是指术后3年内复发者，未复发组是指术后3年以上未复发者，存活组一直随访到1996年12月。

表1　p16、cyclin D₁与膀胱癌生物

　　学行为的关系

　　二、p16与cyclin D₁的相关性

　　在p16阳性者22例中，cyclin D₁阴性者13例，阳性者9例；在p16阴性的28例中，cyclin D₁阴性者6例，阳性者22例；二者有显著相关性，r=-0.3852,P＜0.01。

　　三、p16与cyclin D₁不同结果的组合与膀胱生物学行为的关系

　　病理分级、临床分期、死亡与存活组内比较,p16⁺/Cy^-与p16^-/Cy⁺间,P＜0.05。复发组与未复发组:p16⁺/Cy^-与p16^-/Cy⁺间,P＞0.05(表2)。

表2　p16、cyclin D₁(Cy)不同结果的组合

　　与膀胱癌生物学行为的关系(例)

　　 讨论

　　细胞周期调控研究确立了细胞调控进程的分子机理。这一机理涉及细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶家族(CDKs)以及CDKs抑制蛋白(CKIs)，主要是CDKs的活性表达和调控。cyclin D₁是目前发现的8种细胞周期蛋白中研究最多最深入的一种,它定位于人类11号染色体的短臂(11q13)上，相对分子质量为34 000^［1］。cyclin D₁对细胞增殖具有重要意义^［2］。作为CKIs成员之一的p16,又称MTS1。是人类发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因,位于染色体9P21^［3］,其编码蛋白是CDK4的抑制剂^［4］。p16与以往发现的p53、Rb基因一样均为抑癌基因,而且是一种多肿瘤抑制基因^［3,5］。在许多肿瘤细胞株研究中发现p16基因的缺失和突变率为75%,超过了p53基因50%的突变率^［3］。因此认为p16基因在肿瘤的发生、发展过程中扮演非常重要的角色,是继p53基因之后在肿瘤分子生物学上又一重大发现。p16与cyclin D₁竞争性结合CDK4,共同完成细胞周期的调节。因此检测膀胱癌p16和cyclin D₁的表达情况，有助于进一步了解膀胱肿瘤的生物学行为，并为判断患者的预后提供极有价值的分子生物学指标。

　　我们观测了膀胱移行细胞癌组织切片上p16和cyclin D₁的表达状态及相互关系,显示癌组织p16阳性表达率明显低于癌旁组织和正常膀胱粘膜。癌组织cyclin D₁阳性表达率明显高于癌旁组织和正常膀胱粘膜。随着肿瘤恶性程度的增高,p16表达的阳性率明显下降,cyclin D₁表达的阳性率明显上升。恶性程度低的膀胱肿瘤,p16阳性表达率明显高于高恶性程度的膀胱肿瘤;而cyclin D₁阳性表达率明显低于高恶性程度的膀胱肿瘤。在临床分期资料分析中发现,浅表性肿瘤p16阳性表达率明显高于浸润性或晚期肿瘤,cyclin D₁阳性表达率明显低于浸润性或晚期肿瘤。在预后关系上,复发组及死亡组p16阳性表达率明显低于未复发组和存活组,cyclin D₁阳性表达率则明显高于未复发组和存活组,说明p16和cyclin D₁基因的表达与自然病程密切相关,p16低表达、cyclin D₁高表达是膀胱肿瘤 的晚期表现。p16与cyclin D₁相关性分析看,p16与cyclin D₁的表达呈负相关,与Okamoto等^［6］在人肺、食道、肝、结肠和乳腺肿瘤细胞的研究成果相似。p16阳性而cyclin D₁阴性表达者,具有更强的侵袭性、转移能力，预后较差。p16阴性而cyclin D₁阳性表达者则有相反结果。有15%的病例存在p16和cyclin D₁同时表达或失表达,此时,膀胱肿瘤的生物学行为取决于两者的综合作用。

　　参考文献

　　1　Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene. Nature,1991，350∶512-515.

　　2　Marx J. How cells cycle toward cancer. Science,1994，263∶319-321.

　　3　Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994，264∶436-440.

　　4　Marx J. New tumor suppressor may rival p53. Science,1994，264∶344-345.

　　5　Nobori T, Miura K, Wu DJ,et al.Deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994，368∶753-756.

　　6　Okamoto A, Demetrick DJ,Spillare EA,et al.Mutations and altered expression of p16 ink4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA,1994，91∶11045-11049.

(收稿：1998-09-15)