MMP₂及MMP₉在膀胱癌中的表达及在侵袭转移中的作用

中华泌尿外科杂志 1999年第7期第20卷 论著

作者：宋波　金锡御　潘进洪　杨航　方强

单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；金属蛋白酶

　　【摘要】　目的　探讨MMP₂及MMP₉在膀胱癌中的表达及在侵袭转移中的作用。　方法　采用原位杂交方法观察人膀胱移行细胞癌(TCCB)MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达。　结果　TCCB组织中MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁及TiMP₂表达显著高于正常膀胱上皮，其中MMP₂及MMP₉表达增加较TiMP2及TiMP₁更显著。阳性表达细胞在肿瘤-间质界面较多。随分级升高，MMP₂、MMP₉及MT-MMP₁表达呈增加趋势，而TiMP₁及TiMP₂表达呈下降趋势。死亡患者MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁表达有显著升高，而TiMP₁及TiMP₂有显著下降。结论　MMP₂及MMP₉参与TCCB侵袭和转移，具有较高的预后价值。

The expression of MMP₂ and MMP₉ in transitional cell carcinoma of bladder and its correlation to the tumor invasion and metastasis

SONG Bo，JIN Xiyu,PAN Jinhong,et al.

　　Department of Urology, Southwestern Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the effect of mRNA expression of MMP₂，MMP₉，MT-MMP₁,TiMP₁ and TiMP₂ on transitional cell carcinoma of bladder (TCCB).　Methods　25 human TCCB and 5 normal bladder paraffin embedded tissue were studied by in situ hybridization mRNA.　Results　(1) In TCCB, the mRNA expression of MMP₂, MMP₉, MT-MMP₁, TiMP₁ and TiMP₂　were increased significantly as comparing to normal bladder epithelial and the enhancement of MMP₂ and MMP₉ was greater than that of TiMP₁　and TiMP₂. The positive expression tumor cells tended to gather in the tumor-stroma interface. These suggested that the MMP₂ and MMP₉ were important to Tccb invasion and metastasis. (2) The expression of MMP₂, MMP₉ and MT-MMP₁ tended to increase, With the tumor grade while the expression of TiMP₁ and TiMP₂ tended to decrease. In deadly cases, the expression of MMP₂, MMP₉ and MT-MMP₁ was increased significantly, while the expression of TiMP₁ and TiMP₂ was decreased significantly. In recurrent patients the expression of above mentioned mRNA was not significantly different to that of patients who were free of tumor for more than 5 years.Conclasions These suggested that the expression of MMP₂ and MMP₉ was useful in TCCB prognosis.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Metalloproteinase

　　基底膜是阻碍膀胱移行细胞癌(TCCB)侵袭转移的一道天然屏障。瘤细胞必须穿透膀胱基底膜才能侵入膀胱肌层，必须穿透血（淋巴）管基底膜才能侵入和离开血（淋巴）循环。正常基底膜主要由Ⅳ型胶原等成分构成，为一致密的网状结构，细胞不能自由通过。瘤细胞必须借助某些酶，使基底膜成分有限降解形成小的孔隙，并在其它有关因子的协同作用下完成穿透过程^［1］。MMP₂及MMP₉（Matrix Metalloproteinase 2 and 9）是降解Ⅳ型胶原最主要的酶。本研究用原位杂交观察人TCCB中MMP₂、MMP₉及其相应的活化物和抑制物mRNA表达，探讨其在侵袭转移中的作用和预后价值。

　　材料及方法

　　一、组织标本

　　人TCCB石蜡标本25例。G₁ 8例、 G₂ 9例、G₃ 8例。入选标准：随访时间＞5年,平均随访6.9年；开放手术获取的组织标本；石蜡标本保存完好，HE染色除可见肿瘤外还可见肿瘤与正常膀胱邻接区。正常膀胱石蜡标本5例。

　　二、cDNA探针

　　TiMP₁、TiMP₂（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1，2）及MT-MMP₁（Membrane Type Metalloproteinase 1）cDNA 探针质粒（日本 Kannazawa大学Sato博士惠赠）；MMP₂及MMP₉探针质粒（美国 NIH Stetler-Stevenson教授惠赠）。上述cDNA 探针质粒经转菌扩增，酶切鉴定及地高辛标记后备用。

　　三、原位杂交研究

　　参照文献加以改良^［2］。石蜡切片厚度5μm，二甲苯及无水乙醇脱蜡，梯度乙醇水化，经一系列杂交前处理后分别用制备好的探针进行杂交、显色。为保证结果的可靠性设立了3组阴性对照：(1)先用未标记探针杂交，再用标记探针杂交；(2)用未标记探针杂交；(3)不加探针杂交。为保证杂交信号强度的可比性作了如下安排：每次试验用1个探针检测全套组织标本，当绝大多数标本显色满意后同时全部中止显色。

　　四、阳性表达强度标准

　　高倍视野下计数100个上皮细胞，以阳性细胞百分率加显色强度为标准。弱阳性：阳性细胞≤15% ，显色较浅。强阳性：阳性细胞数＞15%，显色较深。

　　五、统计学处理

　　成对资料χ²检验。

　　结果

　　一、TCCB与正常膀胱比较

　　正常膀胱上皮中MMP₉、TiMP₂的mRNA各有1例为可疑阳性或弱阳性表达，其余均为阴性。TCCB中TiMP₁、TiMP₂及MMP₉表达阴性者分别为2、3和3例，其余均呈阳性表达。TCCB上皮成分与正常膀胱上皮相比在所检测的全部5项指标mRNA表达上均有显著的增强。

　　肿瘤上皮阳性表达细胞和表达强度分布不均匀，在与间质组织、血管邻接面以及肿瘤侵袭入膀胱深层组织指状突起前缘阳性表达细胞多，表达强度也较强。

　　正常膀胱粘膜下和肌束间隔组织中5种成分的mRNA均呈强阳性表达，阳性表达细胞分布较均匀。而肿瘤间质表达强度大多不及正常膀胱间质，且分布不均匀，在与肿瘤上皮的邻接面表达较强。

　　二、TCCB分级与MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达的关系

　　随分级增加，MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁ mRNA表达呈上升趋势，而TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达呈下降趋势(图1)。

图1　MMPs及TiMPs mRNA表达与TCCB分级的关系

　　三、TCCB预后与MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达的关系

　　因肿瘤死亡的病例较之无瘤存活及术后复发者MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁ mRNA表达显著增强，而TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达显著减弱。术后复发者较之无瘤存活者MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁ 表达有增加趋势，而TiMP₁、TiMP₂ 表达有下降趋势，但差异均无显著性(图2)。

图2　MMPs及TiMPs mRNA表达与TCCB预后的关系(A—存活,R—复发，D—死亡)

　　讨论

　　一、MMP₂和MMP₉酶解活性的调节

　　MMP₂和MMP₉是水解IV型胶原最主要的酶。在正常情况下，通过其酶解作用维持细胞外基质中IV型胶原合成与分解代谢之平衡。MMP₂和MMP₉的酶解活性受到多种因素的调节，其中酶的产生量、酶原活化及特异性抑制物产生量是主要的影响因素。MT-MMP₁是MMP₂活化的重要调节因子^［3］。TiMP₂和TiMP₁分别对MMP₂和MMP₉的活化及酶解活性产生特异性的抑制作用^［4］。本研究同时对上述有关因素进行研究，可以减少单因素研究之不足。

　　二、MMP₂和MMP₉与TCCB侵袭的关系

　　本实验显示正常膀胱粘膜下及肌肉间隔组织中MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁及TiMP₂ mRNA均呈强阳性表达，且分布均匀，表明MMP₂和MMP₉参与膀胱间质成分的代谢，并因MMP₂和MMP₉与其相应的抑制物保持相对平衡而使酶活性能维持在生理范围。在正常膀胱上皮中MMP₂和MMP₉无酶解活性，此与文献报告一致^［5］。

　　在TCCB中，MMP₂和MMP₉的作用发生了明显的变化：(1)肿瘤细胞中MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁及TiMP₂ mRNA表达较之正常膀胱上皮有显著增强；(2)MMP₂及MMP₉表达增强较之TiMP₂和TiMP₁更为明显，即酶和酶抑制物比例失去平衡；(3)阳性和强阳性表达的瘤细胞分布不均匀，在肿瘤侵袭方向上表达较高，提示MMP₂和MMP₉表达与TCCB的侵袭转移有着十分密切的关系。

　　有作者认为，肿瘤间质中的MMP₂和MMP₉是造成肿瘤侵袭转移的主要原因^［6］，但未描述正常间质中的表达情况。本研究显示肿瘤间质中的MMP₂和MMP₉的表达强度多数均低于正常膀胱间质，且分布不均匀，但在与瘤细胞的邻接面表达较高，说明肿瘤间质组织中MMP₂和MMP₉表达在某种程度上参与肿瘤的侵袭转移。但基于肿瘤细胞出现的变化更为显著，我们认为肿瘤细胞MMP₂和MMP₉表达与TCCB侵袭转移关系更为密切。

　　三、MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁、TiMP₁、TiMP₂ mRNA表达与TCCB预后的关系

　　有关TCCB侵袭转移及预后与MMP_s关系，文献报道结果不一致。有作者对膀胱癌组织研究认为MMP₉升高和TiMP₂升高与TCCB预后有关^［7，8］；有作者发现血浆TiMP₁降低和MMP₂/TiMP₁比值升高预示侵袭性TCCB，预后不佳^［9，10］。

　　本研究显示：(1)随TCCB分级升高，MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁表达呈上升趋势，而TiMP₁、TiMP₂表达呈下降趋势，其中8例G₃肿瘤MMP₂均呈强阳性表达，表明MMP₂和MMP₉酶解活性与TCCB分级有一定关系，其中以MMP₂关系更为明显；(2)死亡患者与无瘤存活及术后复发患者相比，MMP₂、MMP₉、MT-MMP₁表达显著升高，而TiMP₁及TiMP₂表达显著下降。6例死亡患者MMP₂和MT-MMP₁均呈强阳性表达，而TiMP₁表达4例为弱阳性，1例为阴性，表明MMP₂和MMP₉表达升高具有较好的预后价值，其中MMP₂表达升高更具预后价值；（3）MMP₂及MMP₉在预测术后复发中的价值较小。TCCB多为浅表性，向膀胱腔方向生长，侵袭转移发生相对较晚。但少数早期即呈侵袭性生长，转移发生亦较早，研究与侵袭转移直接相关的因子可望为阐明这种现象的产生原因及提供预后标记物提供帮助。

　　参考文献

　　1　Ray JM,Stetler-Stevenson WG.The role of matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor invasion, metastasis and angiogenesis. Eur Respir J, 1994， 7∶2062-2072.

　　2　蔡文琴，王伯氵　云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994，77-96.

　　3　Sato H, Seiki M. Membrane-type matrix metalloproteinases (MT-MMPs) in tumor metastasis. J Biochem，1996， 119∶ 209-215.

　　4　Strongin AY， Collier I， Bannokvo G. et al. Mechanism of cell surface activation of 72-Kd type IV collagenase. J Biol Chem， 1995， 270: 5331-5338.

　　5　Sutherland RS, Baskin LS, Elfman F， et al. The role of type IV collagenases in rat bladder development and obstruction. Pediatr Res. 1997，41∶430-434.

　　6　Bei B, Bucana CD,Fidler IJ. Density-dependent induction of 92-Kd type IV collagenase activity in cultures of A431 human epidermoid carcinoma cells.Am J Pathology. 1994，114∶1058-1067.

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　　8　Gohji K, Fujimoto N, Fujii A.Prognostic significance of circulating matrix metalloproteinase-2 to tissue inhibitor of metalloproteinase-2 ratio in recurrent of urothelial cancer after complete resection. Cancer Res，1996，56∶3196-3198.

　　9　Miyake H, Yoshimura K, Hara I. Basic fibroblast growth factor regulates matrix metalloproteinases produced and in vitro invasiveness in human bladder cancer cell lines. J Urol，1997，157∶2351-2355.

　　10　Gohji K, Fujimoto N, Komiyama T,et al. Elevation of serum le-vels of matrix metalloproteinases-2 and 3 as new predictors of recurrence in patients with urothelial carcinoma. Cancer，1996，78∶2379-2387.

(收稿：1998-08-12　修回：1999-02-09)