PKC基因在人肺癌中的转录表达

中国肺癌杂志 2000年第5期第3卷 论著

作者：周清华　刘伦旭　李潞　王允　陈军　杨金龙

单位：周清华　刘伦旭　李潞　王允　陈军　杨金龙(华西医科大学附属第一医院肿瘤中心　成都，610041)

关键词：肺肿瘤；PKC基因；RNA印迹杂交

　　【摘要】目的　探讨PKC-β₁基因转录表达与肺癌临床病理生理特征的关系。方法　应用Northern印迹杂交方法检测50例肺癌组织、癌旁肺组织、远癌肺组织和30例肺良性病变肺组织PKC-β₁ mRNA表达水平。结果　(1)肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达水平显著高于癌旁肺组织，远癌肺组织和肺良性病变肺组织(P＜0.01)；(2)低分化肺癌中PKC-β₁表达水平显著高于中-高分化肺癌(P＜0.05)；(3)Ⅲ期肺癌PKC-β₁表达水平显著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌(P＜0.01)；(4)伴有淋巴结转移肺癌PKC-β₁表达水平显著高于不伴淋巴结转移肺癌(P＜0.01)。结论　肺癌组织中存在PKC-β₁ mRNA过度表达，它可能参与肺癌细胞分化以及肿瘤进展和转移过程的调控。

　　【中图分类号】R734.2；Q754

The transcript expression of PKC-β₁ gene in human lung cancer

ZHOU Qinghua,LIU Lunxu,LI Lu,WANG Yun,CHEN Jun,YANG Jinlong

　　(Cancer Center,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To determine the relationship between the transcript expression of PKC-β₁ gene and pathophysilogical characteristics of lung cancer.Methods　The expression of PKC-β₁ mRNA was detected in 50 human lung cancer tissues,para-cancerous tissues,non-cancerous tissues and 30 benign pulmonary lession tissues by Northern blot.Results　(1) The expression level of PKC-β₁ mRNA in lung cancer tissues was significantly higher than that in para-cancerous tissues,non-cancerous tissues and benign pulmonary lession tissues (P＜0.01).(2) The expression level of PKC-β₁ in poor-differentiated cancer was significantly higher than that in moderate-well differentiated cancer (P＜0.05).(3) The expression of PKC-β₁ mRNA in stage Ⅲ cancer was remarkably higher than that in stage Ⅰ and stage Ⅱ disease (P＜0.01).(4) The expression of PKC-β₁ in cancer with lymph node metastasis was significantly higher than that in the cancer without lymph node involvement (P＜0.01).Conclusion　There is an overexpression of PKC-β₁ mRNA in lung cancer tissues,and it may play an important role in the advancement,cancer cell differentiation and metastasis of lung cancer.

　　【Key words】Lung neoplasms　　PKC gene 　　Northern blot

　　肿瘤的发生、发展和转移是一个极其复杂的过程。在这一过程中除有许多癌基因、肿瘤抑制基因、转移抑制基因参与外，还有许多信号传递因子和介质的参与。目前，已知有多种类型的信号传递因子和介质，其中研究较多的一类是蛋白激酶家族，PKC就是蛋白激酶家族中的一个重要成员。现有的研究表明PKC可能参与肿瘤发生、发展、转移和多药耐药等过程的信号传递^［1］。为了探讨肺癌组织中PKC-β₁基因mRNA的表达水平及其与肺癌临床病理生理特征的关系，本研究应用Northern blot检测了50例肺癌组织中PKC-β₁ mRNA的转录表达水平，并以相同病例的癌旁肺组织、远癌肺组织及30例良性病变肺组织作对照，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　组织标本　来源于外科手术的50例肺癌患者和30例肺良性疾病患者。肺癌病例中男性37例，女性13例；年龄38～72岁，平均54.42岁。在50例肺癌中，鳞癌20例，腺癌16例，大细胞癌14例；伴淋巴结转移者30例，不伴淋巴结转移者20例。术后病理分期按1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的分期标准分期。在30例良性肺病变中，结核瘤11例，炎性假瘤10例，肺囊肿9例。

　　1.2　质粒和主要试剂　PKC-β₁ cDNA重组质粒和γ-actin cDNA重组质粒均由美国Vanderbilt大学Arteaga教授惠赠。地高辛DNA标记试剂盒、地高辛荧光检测试剂盒购于德国宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)。

　　1.3　RNA和质粒DNA提取　组织总RNA的提取采用异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法，提取的组织总RNA溶解于0.5％SDS溶液中，－84℃冰箱保存。

　　质粒DNA提取采用碱裂解法，PKC-β₁和γ-actin cDNA探针的非放射性地高辛标记采用随机引物法。

　　1.4　Northern印迹杂交　肺组织标本中PKC-β₁的相对表达强度检测，应用地高辛免疫荧光药盒，以γ-actin作为内参照，采用Northern印迹杂交方法进行半定量分析。取组织总RNA 30?μg在甲醛变性电泳缓冲液中电泳分离，用毛细管洗脱法将其转移到尼龙膜上，254?nm紫外光按0.12?J／cm²的强度照射，将核酸不可逆固定后，在含PKC-β₁和γ-actin探针各50?μg／ml的高SDS杂交液中42℃条件下，杂交16小时，采用0.5×SSC、0.1％SDS 58℃下洗膜2次，按地高辛免疫荧光检测试剂盒说明书内容检测，记录杂交信号于X-线胶片上，摄入UVP白光、紫外光成像系统，用Gel-scan图像分析系统检测PKC-β₁和γ-actin的表达强度，计算PKC-β₁的相对表达强度。

　　1.5　统计学处理　本研究所有数据为计量资料，经统计学分析方差齐性，采用F检验或t检验。

　　2　结果

　　2.1　组织PKC-β₁ cDNA及γ-actin cDNA回收提纯后电泳检测，可见分别位于8.5?kb和0.8?kb处的条带，与预期值相符。

　　2.2　在杂交缓冲液中加入PKC-β₁和γ-actin两种探针，检测组织mRNA中PKC-β₁的表达情况，显示在0.8?kb处各组织标本均有杂交带出现，该带为γ-actin杂交带；部分组织标本在8.5?kb处有一新条带，为PKC-β₁杂交带，与文献报道相符(图1)。

　　2.3　肺癌组织、癌旁组织、远癌肺组织、良性病变肺组织中PKC-β₁ mRNA转录表达强度比较(表1)　肺癌组织、癌旁组织、远癌肺组织和良性病变肺组织的PKC-β₁ mRNA平均表达强度分别为234.51±21.30、123.02±19.26、114.39±20.01和117.20±14.03，经F检验，四组间具有非常显著差异(P＜0.01)；两两比较：肺癌PKC-β₁ mRNA表达强度显著高于癌旁组织、远癌组织和良性病变肺组织(P＜0.01)，而癌旁肺组织、远癌肺组织和良性病变肺组织之间PKC-β₁ mRNA表达强度两两比较均无显著差异(P＞0.05)。

图 1　Northern印迹杂交分析PKC-β₁基因mRNA在肺组织中的表达

　　1：正常肺组织；2～4、7、9：肺癌组织；

　　5：良性病变肺组织；6、8：癌旁肺组织

　　Fig 1　Northern blot analysis of PKC-β₁ mRNA in lung tissues

　　1: Normal pulmonary tissues; 2～4,7,9: Lung cancer tissues;

　　5: Benign pulmonary lesion tissues; 6,8: Para-cancerous tissues

表1　肺癌、癌旁、远癌肺组织、良性病变肺组织

　　PKC-β₁基因mRNA相对表达强度比较

　　Tab 1　Comparison of expression of PKC-β₁ mRNA in cancer,

　　para-cancer,non-cancer and benign pulmonary lession tissues

　　2.4　肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达强度与肺癌临床病理生理特征的关系

　　2.4.1　肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达强度与肺癌病期的关系　肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达强度随病期进展而增高，三组间比较有非常显著差异(P＜0.01)；两两比较：Ⅲ期肺癌PKC-β₁ mRNA表达强度显著高于Ⅱ期和Ⅰ期肺癌(P＜0.01)，Ⅱ期肺癌显著高于Ⅰ期肺癌(P＜0.05)(表2)。

表2　不同病期肺癌PKC-β₁ mRNA相对表达强度比较

　　Tab 2　Comparison of expression of PKC-β₁ mRNA

　　in different stages of lung cancer

　　2.4.2　肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达强度与肺癌组织学类型的关系　肺鳞癌、腺癌和大细胞肺癌三组间PKC-β₁ mRNA表达水平有非常显著差异(P＜0.01)；两两比较：鳞癌PKC-β₁表达水平显著高于腺癌和大细胞癌(P＜0.01)，腺癌与大细胞癌之间有显著性差异(P＜0.05)(表3)。

　　2.4.3　肺癌中PKC-β₁ mRNA表达强度与肺癌细胞分化程度的关系　低分化肺癌PKC-β₁ mRNA表达强度显著高于中-高分化肺癌(P＜0.05)(表4)。

　　2.4.4　PKC-β₁ mRNA表达强度与淋巴结转移的关系　N_1-3肺癌PKC-β₁ mRNA表达强度显著高于N₀肺癌(P＜0.01)(表5)。

表3　不同组织学类型肺癌PKC-β₁ mRNA相对表达强度比较

　　Tab 3　Comparison of expression of PKC-β₁ mRNA in

　　different histological classification of lung cancer

表4　低分化肺癌与中-高分化肺癌PKC-β₁ mRNA

　　相对表达强度比较

　　Tab 4　Comparison of expression of PKC-β₁ mRNA between

　　poor differentiated and moderate-well differentiated lung cancer

表5　伴淋巴结转移和不伴淋巴结转移肺癌

　　PKC-β₁ mRNA相对表达强度比较

　　Tab 5　Comparison of expression of PKC-β₁ mRNA

　　in lung cancer between with and without lymph node metastasis

　　3　讨论

　　蛋白激酶C是1977年由Nishizuka发现的^［2～4］。迄今，已从不同种属的组织和器官中分离、纯化出至少11种不同的PKC亚型，它们是由不同基因编码的功能相似的同功酶，在细胞信号传递、肿瘤的发生、发展，以及转移过程中均发挥重要作用^［5～9］。

　　PKC-β₁基因是一种细胞信号传递和多药耐药相关基因，与肿瘤发生、发展、转移和多药耐药过程中的信号传递密切相关。在黑色素瘤、胰腺癌、肺癌等的研究中均发现存在PKC基因过度转录表达^{［1～3，8］}。Sheski等^［2］的研究还证实小细胞肺癌对血管内皮细胞的粘附作用，是通过PKC旁路的激活来实现的。如果应用PKC抑制剂BIN与血管内皮细胞预培养，可阻断TNF-α介导的肺癌细胞对血管内皮细胞的粘附作用。本研究应用Northern印迹杂交方法，研究肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达与肺癌临床病理生理特征的关系。本研究观察到肺癌组织中PKC-β₁ mRNA表达水平显著高于癌旁肺组织、远癌肺组织和肺良性病变肺组织(P＜0.01)，而癌旁肺组织与远癌肺组织和良性病变肺组织，以及远癌肺组织和良性病变肺组织间均无显著性差异(P＞0.05)。本研究结果提示肺癌中存在PKC-β₁基因mRNA过度表达。

　　有关PKC-β₁表达强度与肺癌组织类型的关系，文献中已有少数报道。周清华等^［1］从蛋白水平观察到肺鳞癌中PKC表达水平显著高于腺癌和大细胞癌。本研究进一步从mRNA水平证实肺鳞癌中PKC-β₁表达水平显著高于肺腺癌和大细胞肺癌。该结果有助于解释肺鳞癌对化疗的敏感性较腺癌和大细胞癌差的临床特征；同时进一步证明肺鳞癌对化疗敏感性差的原因可能与其PKC mRNA过度表达有关。

　　有关PKC基因表达强度与肿瘤转移关系的研究，文献中仅有个别报道，而与肺癌转移关系的研究文献尚未见有报道。1998年，Dennis等^［3］为了确定PKC-α表达改变是否可影响人黑色素细胞瘤转移潜能，在体外将C8161黑色素瘤细胞与反义PKC-α转染，并培养，然后将转染反义PKC-α的细胞株和对照株经静脉注射到小鼠体内，观察到转染反义PKC-α的黑色素瘤细胞的转移率较对照组降低了75％。作者认为PKC-α在调节黑色素瘤转移中起重要作用。本研究观察到N_1-3肺癌PKC-β₁ mRNA表达强度显著高于N₀肺癌(P＜0.01)。此外，本研究还观察到PKC-β₁ mRNA表达水平与肺癌细胞分化程度和病期有密切关系。低分化肺癌较中-高分化肺癌PKC-β₁过度表达更明显(P＜0.01)，中晚期肺癌亦较早期肺癌PKC-β₁过度表达更明显(P＜0.01)。

　　综上所述，本研究在国内首次报道肺癌中存在PKC-β₁ mRNA过度表达，PKC-β₁过度表达与肺癌病期、组织学类型、细胞分化程度、淋巴结转移等有密切关系。PKC基因在介导肺癌多药耐药中起重要的信号传递作用，但其机理尚未完全明了，需要进行更深入的研究加以阐明。

　　本研究受国家自然科学基金(39670718)资助

　　参考文献

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收稿日期：1999-08-19

修回日期：1999-10-13