Adp27^KIP1基因的过度表达对人膀胱癌细胞系EJ的抑制作用

中华泌尿外科杂志 1999年第12期第20卷 论　著

作者：王刚　薛兆英　张志文　姜学军　俞莉章　郭应禄

单位：100034 北京医科大学第一医院泌尿外科　北京医科大学泌尿外科研究所

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；腺病毒，人

　　【摘要】　目的　探讨p27^KIP1的过度表达对人膀胱 癌细胞系EJ的影响。　方法　构建含人p27^KIP1基因的重组缺陷腺病毒，并感染EJ细胞，72小时后检测p27^KIP1蛋白的表达、生长曲线、克隆形成率 和细胞周期分布。　结果　转基因后，EJ细胞过度表达p27^KIP1 蛋白，增殖明显受阻，细胞停滞于G₁期。　结论　p27^KIP1 的过度表达可明显抑制EJ细胞的增殖，提示p27^KIP1基因在人膀胱癌的发生中起重 要作用，用重组腺病毒转p27^KIP1基因可成为潜在的膀胱癌治疗方法。

Inhibition of human bladder tumor cell line EJ by adenovirus-mediated over-expression of human p27^KIP1

　　WANG Gang,XUE Zhaoying,ZHA NG Zhiwen,et al.Department of Urology, First Affiliated Hospital,Institute of Ur ology, Beijing Medical University, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To investigate the influence of over-expression of p27^KIP1 on the malignant phenotype of EJ human bladder carcinoma cell line.　Methods　A recombinant replicatio n defective adenovirus, Adp27^KIP1, was constructed and used to infect EJ c ells. Seventy-two hours after infection, the expression of p27^KIP1 protei n in EJ was tested and the biological behavior of EJ was evaluated by growth curves, cloning efficiency and cell cycle distribution.　Results　Over-expression of p27^KIP1 protein was observed in Adp27^KIP1 -infected cells. As a result, the proliferation of the cells was greatly inhibi ted, the cells being arrested in G1 phase.　Conclusions　The over-expression of p27^KIP1 may inhibit the proliferation of EJ cells, suggesting that p27^KIP1 play a pivotal role in the genesis of bladder carc inoma and that Adp27^KIP1 might be used as a potential therapeutic method f or the disease.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Adenovirus,human

　　细胞增殖受细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(CDK)的促进，受CDK抑制因子(CKI )的抑制^［1］。p27^KIP1是一种重要的CKI，于1994年被发现^［2］，并 克隆其基因^［3］。研究发现，静止期细胞p27^KIP1的含量很高，而增殖活 跃的细胞中其含量明显降低^［2,3］。p27^KIP1表达降低者前列腺癌恶性程度较 高，预后较差^［4］，表明它在肿瘤发生中起重要作用。因此，从细胞周期入手研究 膀胱癌的发病机制是一种有益的尝试。我们构建了含人p27^KIP1基因的重组缺陷腺病 毒Adp27^KIP1，并观察其在体外对人膀胱癌细胞系EJ的作用。

　　材料和方法

　　一、Adp27^KIP1的构建

　　将质粒pACCMVp27^KIP1和pJM17(美国德州大学西南医学中心Perry D. Nisen博士 赠)扩增，在293细胞中同源重组得到含人p27^KIP1基因的重组复制缺陷腺病毒Adp27 KIP1，测定滴度，以5～10∶1感染细胞。以不含p27^KIP1基因的重组缺陷腺病毒A dβGal作为对照。

　　二、细胞培养

　　人膀胱癌细胞系EJ：培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640。细胞在80%满瓶时，感染Adp2 7^KIP1和AdβGal，72小时后收集细胞检测。以感染Adp27^KIP1的EJ为实验组， 以感染AdβGal的EJ为阴性对照，以未感染病毒的EJ为空白对照。

　　三、免疫组化

　　用培养液将细胞制成单细胞悬液，滴于无菌载玻片上，常规条件下孵育至细胞贴壁伸展，加 入p27^KIP1抗体(Santa Cruz公司)，用LSAB法进行免疫组化染色。

　　四、蛋白印迹分析

　　细胞用裂解液裂解，上清中总蛋白用10%SDS-PAGE电泳分离、转膜，在兔抗人p27^{K IP1}多克隆抗体中孵育，用碱性磷酸酶显色法显色。

　　五、生长曲线

　　以每孔1×10⁴个细胞将细胞接种于24孔板，每48小时换液一次，每24小时计数一次；每 种细胞每天数4孔，共6天。

　　六、克隆形成率

　　每个直径6cm双层软琼脂平皿中加含3×10³个细胞的单细胞悬液，培养14天后计数所形成 的克隆数。

　　七、细胞周期分布

　　将细胞用PBS制成2×10⁵/ml的单细胞悬液，70%乙醇固定16小时，加少量RNA酶和1%碘化丙啶孵育30分钟，流式细胞仪检测细胞DNA含量。

　　八、统计方法

　　用精确概率法检测克隆形成率的差异性，用构成比的χ²检验检测细胞周期分布的差异性。

　　结　果

　　一、实验组细胞中p27^KIP1的过度表达

　　1、免疫组化：由于p27^KIP1是一种核蛋白，因此免疫组化为核染色。实验组细胞 中p27^KIP1染色集中在细胞核，呈强阳性；而在阴性对照和空白对照细胞中，虽然细 胞质稍有染色，但细胞核没有明显的p27^KIP1蛋白表达，因此呈阴性。

　　2、蛋白印迹分析：实验组细胞在相对分子质量27 000附近有阳性条带，检出明显表达 的p27^KIP1蛋白；阴性对照细胞中可检测到微量p27^KIP1蛋白，而空白对照细胞 中几乎检测不到p27^KIP1蛋白。

　　二、实验组细胞生物学性状的变化

　　1.分裂增殖：两对照组细胞增殖旺盛，镜下可见较多核分裂相，倍增快；而实验组细胞的 增殖停滞，生长曲线低平(图1)；镜下看不出分裂的迹象，细胞形态变大，核浆比减小， 有成团聚集的倾向；随着培养时间的延长，实验组细胞数目开始缓慢减少。

图1　生长曲线。A：对照，未感染的EJ细胞，增殖旺盛；B： 对照，

　　A、 B两组间差异无显著性，两组与C组间差异有显著性

　　2.克隆形成率：实验组细胞克隆形成率为0，而阴性对照组和空白对照组细胞克隆形成率分 别为0.9%和1.0%。精确概率法显示实验组和对照组间差异有显著性(P=4.55×10^－7 )。

　　3.细胞周期分布：试验组G₁期95.4%，S期4.1%，G₂～M期0.5%；阴性对照组G₁期7 3.4%，S期17.5%，G₂～M期9.1%；空白对照组：G₁期79.0%，S期14.3%，G₂～M期6 .7%。统计学上两对照组间差异无显著性(χ²=0.902，P=0.6369)，而两对照组与实验 组间差异有显著性(χ²=18.45，P＜0.01)。

　　讨　论

　　一、腺病毒载体进行膀胱癌基因转移的优点

　　重组腺病毒DNA中含有真核表达启动子CMV，并去除了E₁部分，因此重组腺病毒能够在 宿主细胞中表达但不能复制^［5］。实验显示，感染重组复制缺陷腺病毒Adp27^{KI P1}后，EJ细胞中p27^KIP1蛋白过度表达，说明利用重组腺病毒可以将p27^KIP1 基因转入人膀胱癌细胞中并在其中表达p27^KIP1蛋白。文献报告通过腺病毒介导可 以将p27^KIP1基因转入人脑星形细胞瘤U-373MG细胞^［6］和小鼠心血管内皮细 胞，并在其中表达。本实验结果与文献一致。p27^KIP1的过度表达可以抑制肿瘤细胞 的增殖，表明腺病毒可以作为人膀胱癌基因治疗的有效载体。

　　腺病毒载体以其多种优点成为现在广泛应用的基因转移手段。其最大的优点是安全性很高， 用于载体的5型腺病毒不会引起鼠类的肿瘤，在人类只会引起轻微的呼吸道症状；而且外源 基因不整合到宿主染色体中，还避免了插入突变的危险^［5］。其次，可插入外源基 因的容量大，可达7～8kb；并可以高效地在体内体外感染分裂细胞与非分裂细胞。另外，它稳定、易纯化，滴度可高达10¹¹～10¹²pfu/ml^［5］(空斑形成单位plaq ue forming unit, pfu)，而逆转录病毒只有10⁶　pfu/ml。但腺病毒载体也存在一些缺点 ， 如特异性不高、表达时间较短等，而且机体可产生免疫力，使得再次基因转移很困难。我们 在实验中观察到，高滴度的病毒可产生细胞毒性作用。这些缺点可以通过构建含组织特异性 启动子的载体、转入组织特异性表达的基因、减少腺病毒免疫性等方法解决。尽管如此，用 腺病毒进行转基因治疗膀胱癌理论上是可行的。

　　二、p27^KIP1是抑癌基因，在膀胱癌发病中起重要作用

　　EJ细胞是国际公认的膀胱癌细胞系，体外培养能无限增殖，生长旺盛。在本试验中，两 对照组的EJ细胞增殖旺盛，倍增时间很短，免疫组化和蛋白印迹分析结果显示其p27^{KIP 1}的表达很少；而转入p27^KIP1基因的EJ细胞中p27^KIP1呈现过度表达。进一 步检测发现：该组细胞成团聚集、核浆比减少，表明有良性逆转的倾向；细胞克隆形成率降 低、生长曲线低平，表明细胞停止分裂增殖；细胞周期分布证实了增殖受阻的细胞停滞于G ₁期。上述结果说明：p27^KIP1基因的过度表达可以抑制人膀胱癌细胞EJ的增殖，使 恶性表型逆转。

　　文献报告将正常人p27^KIP1基因转入不同的人肿瘤细胞系中，增加了p27^KIP1蛋 白的表达，使其恶性表型逆转，增殖减缓或停滞，成瘤性降低^［6］，这与本实验结 果吻合。相反，通过转反义p27^KIP1cDNA，在细胞中表达反义p27^KIP1mRNA可使 成纤维细胞CCL39中的p27^KIP1蛋 白的表达量降低，在无血清培养基中可增殖数代^［7］。基因剔除实验表明，p27基因 等位缺失小鼠形体增大，出现与p53基因等位缺失小鼠类似的自发垂体肿瘤的现象^［8］ 。上述研究 表明，人为地减少p27^KIP1蛋白的表达，可使正常细胞出现恶性倾向；而增加其表达 可使某些肿瘤细胞恶性表型逆转。因此，可以把p27^KIP1看作抑癌基因，在很多肿 瘤包括膀胱癌的发病中起重要作用。

　　p27^KIP1的作用机制，是抑制了大多数Cyclin-CDK复合物的活性。其中主要是Cyclin E-CDK₂和CyclinD-CDK₄复合物，它们是Rb蛋白的磷酸化酶，在G₁晚期促进细胞向S 期 转化，当其活性被p27^KIP1抑制后，不能将Rb蛋白磷酸化，亚磷酸化的Rb蛋白就与转 录调节因子如E2F等结合，阻止E2F启动有关DNA合成所需酶的转录，从而起到抑制细胞增殖 的作用^［9］。

　　参考文献

　　1　Xavier G, Reddy EP. Cell cycle control in mammalian cells: role of cy clins, cyclin dependent kinases(CDKs), growth suppressor genes and cyclin-depen dent kinase inhibitors(CKIs). Oncogene, 1995,11∶211-219.

　　2　Polyak K, Kato J, Solomon M, et al. p27^KIP1, a cyclin-CDK inhibitor, l inks transforming growth factor-β and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes & Dev, 1994,8∶9-22.

　　3　Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, et al. Cloning of p27^KIP1, a cy clin-dependent kinase inhibitor and potential mediator of extracellular antimit ogenic signals. Cell, 1994,78∶59-66.

　　4　Tsihlias J, Kapusta LR, DeBoer G, et al. Loss of cyclin-dependent kinase inh ibitor p27^KIP1 is a novel prognostic factor in localized human prostate ad enocarcinoma. Cancer Res, 1998, 58∶542-548.

　　5　Kremer EJ, Perricaudet M. Adenovirus and adeno-associated virus mediated gen e transfer. Br Med Bulletin,1995, 51∶31-44.

　　6　Chen J, Willingham T, Shuford M, et al. Tumor suppression and inhibition of a neuploid cell accumulation in human brain tumor cells by ectopic overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27^KIP1. J Clin Invest, 1996, 97 ∶1983-1988.

　　7　Rivard N, L'Allemain G, Bartek J, et al. Abrogation of p27^KIP1 by cDNA antisense suppresses quiescence (G₀ state) in fibroblasts. J Bio Chem, 1996,27 1∶18337-18341.

　　8　Nakayama K, Ishida N, Shirame M, et al. Mice lacking p27^KIP1 display in creased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia, and pituitary tumors. Cell,1996, 85∶707-720.

　　9　Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science, 1996, 274∶1672-1677.

(收稿：1999-02-12　修回：1999-07-09)